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熒光定量PCR檢測
熒光定量PCR是檢測生物樣品中RNA含量的最普遍的方法,通過(guò)熒光染料或熒光標記的特異性的探針,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標記跟蹤,實(shí)時(shí)在線(xiàn)監控反應過(guò)程,結合相應的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析,計算待測樣品模板的初始濃度。目前主要使用Sybr green和taqman法對RNA含量進(jìn)行檢測。Sybr green在低樣本量時(shí)成本較低,目前選用的較多。
SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結合的熒光染料。當它與DNA雙鏈結合時(shí),發(fā)出熒光;從DNA雙鏈上釋放出來(lái)時(shí),熒光信號急劇減弱。因此,在一個(gè)體系內,其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過(guò)程是:1、開(kāi)始反應,當SYBR Green染料與DNA雙鏈結合時(shí)發(fā)出熒光。2、DNA變性時(shí),SYBR Green染料釋放出來(lái),熒光急劇減少。3、在聚合延伸過(guò)程中,引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后,SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結合,定量PCR系統檢測到熒光的凈增量加大。
實(shí)驗流程:細胞或組織RNA提取-RNA濃度檢測-RNA逆轉錄-定量PCR檢測。
結果示例:
圖 A 基因擴增曲線(xiàn)圖;B 基因擴增溶解曲線(xiàn)圖;C mRNA相對表達量變化
從圖中可以擴增曲線(xiàn)可以看出目的RNA擴增效果,溶解曲線(xiàn)可以看出引物識別特異性情況,通過(guò)使用ΔΔCt方法計算可以得到每個(gè)組中目的mRNA表達變化。
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