關(guān)于熒光定量PCR檢測
關(guān)鍵詞：第三方檢測機構 pcr 基因檢測 檢測 pcr實(shí)驗室 pcr技術(shù) 熒光定量pcr 第三方檢測中心
1. 簡(jiǎn)介
聚合酶鏈式反應 (PCR) 是分子生物學(xué)領(lǐng)域功能最強大的技術(shù)之一。采用 PCR 技術(shù)，利用序列特異性寡核苷酸、熱穩定性 DNA 聚合酶和熱循環(huán)，可將 DNA 或 cDNA 模板內的特異性序列拷貝或“擴增”數千至數百萬(wàn)倍。在傳統(終點(diǎn)) PCR 中，擴增序列的檢測和定量是在反應結束，即最后一次 PCR 循環(huán)完成后進(jìn)行的，且需要 PCR 后分析，
利用具有熱循環(huán)功能及熒光染料篩查能力的儀器，檢測反應過(guò)程中熒光的變化。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀通過(guò)繪制熒光與循環(huán)數曲線(xiàn)，生成擴增曲線(xiàn)，表示在整個(gè) PCR 反應過(guò)程中積聚的產(chǎn)物 (圖 1)。
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的優(yōu)點(diǎn)包括：
如凝膠電泳和圖像分析。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR) 中， 每次循環(huán)均檢測PCR產(chǎn)物。通過(guò)監測指數擴增期的反應， 用戶(hù)可以確定靶點(diǎn)的起始量，且精度極高。
在理論上，PCR 可呈指數型擴增DNA，使每個(gè)擴增循環(huán)中的靶分子數倍增。在 PCR 問(wèn)世之初，科學(xué)家推斷，通過(guò)與已知標準品進(jìn)行比較，利用循環(huán)數和 PCR 終產(chǎn)物的量可以計算出遺傳物質(zhì)的起始量。為達到可靠定量的要求，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)得以問(wèn)世。如今終點(diǎn) PCR 主要用于擴增特定的 DNA，用于測序、克隆及其它分子生物學(xué)技術(shù)。
在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 中，每次循環(huán)結束后通過(guò)熒光染料檢測 DNA 的量，熒光染料產(chǎn)生的熒光信號與生成的 PCR 產(chǎn)物分子 (擴增片段) 數直接成正比。利用反應指數期采集的數據，生成有關(guān)擴增靶點(diǎn)起始量的定量信息。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 使用的熒光報告基團包括雙鏈 DNA (dsDNA) 結合染料或在擴增過(guò)程中摻入 PCR 產(chǎn)物的、與 PCR 引物或探針結合的染料分子。
• 能夠實(shí)時(shí)監控 PCR 反應的進(jìn)程
• 能夠精確測定每個(gè)循環(huán)的擴增片段數量，從而對樣本中的起始材料量進(jìn)行準確定量
• 具有更大的檢測動(dòng)態(tài)范圍
• 在單管中實(shí)現擴增和檢測，無(wú)需 PCR 后處理
在過(guò)去的數年中，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 已成為 DNA 或 RNA 檢測和定量的主要工具。采用上述技術(shù)，您可以實(shí)現精確的檢測，其準確度低至2倍范圍，起始材料的動(dòng)態(tài)范圍達
6 至 8 個(gè)數量級。
圖 1. 相對熒光與循環(huán)數。 通過(guò)繪制每個(gè)樣本的熒光信號與循環(huán)數曲線(xiàn)，生成擴增曲線(xiàn)；因此，擴增曲線(xiàn)表示在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 實(shí)驗過(guò)程中積聚的產(chǎn)物。用于創(chuàng )建本圖曲線(xiàn)的樣本是連續梯度稀釋的 DNA 靶序列。
2.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 概述
本部分將概括實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的步驟。實(shí)時(shí)熒光定量
PCR 是在標準 PCR 技術(shù)基礎上演變而成，常用于定量樣本中的 DNA 或 RNA。利用序列特異性引物，可測定特定的 DNA 或 RNA 序列的拷貝數。通過(guò)檢測 PCR 循環(huán)的每個(gè)階段中擴增產(chǎn)物的量，實(shí)現定量。如果樣本中存在高豐度的特定序列 (DNA 或 RNA)，則在早期循環(huán)中即可觀(guān)察到擴增；如果序列較少，則在晚期循環(huán)中方可觀(guān)察到擴增。
利用熒光探針或熒光 DNA 結合染料，采用實(shí)時(shí)熒光定量
PCR 儀檢測熒光并完成 PCR 反應所需的熱循環(huán)，實(shí)現擴增產(chǎn)物的定量。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的步驟
實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應的每個(gè)循環(huán)包括三個(gè)主要步驟。一般運行 40 個(gè)循環(huán)。
1. 變性：利用高溫孵育將雙鏈 DNA“熔解”為單鏈，并松開(kāi)單鏈 DNA 的二級結構。一般采用 DNA 聚合酶可耐受的最高溫度 (通常為 95°C)。如果模板 GC 含量較高，則延長(cháng)變性時(shí)間。
2. 退火：在退火過(guò)程中，互補序列有機會(huì )發(fā)生雜交，因此，應根據計算所得的引物熔解溫度 (Tm)，使用適當的溫度 (通常較引物的 Tm 低 5°C)。
3. 延伸：在 70-72°C 之間，DNA 聚合酶的活性最佳，引
物延伸速度達每秒 100 個(gè)堿基。當實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 中的擴增片段較小時(shí)，通常將該步驟與退火步驟合 并，溫度為 60°C。
采用了隨機引物或 oligo(dT) 和隨機引物的混合物。
cDNA 合成采用的溫度取決于所選的 RT 酶。逆轉錄完成后，將約 10% 的 cDNA 轉移至單獨的管中，完成實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應。
兩步法qRT-PCR
兩步法定量逆轉錄 PCR (qRT-PCR) 的第一步是采用逆轉錄酶 (RT) 將總 RNA 或 poly(A) RNA 逆轉錄為 cDNA。采用隨機引物、oligo(dT) 或基因特異性引物 (GSP) 完成第一鏈
cDNA 合成反應。為在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 應用中平均表示所有靶點(diǎn)并避免 oligo(dT) 引物的 3’ 偏差，許多研究人員
擴增；如果序列較少，則在晚期循環(huán)中方可觀(guān)察到擴增。
利用熒光探針或熒光 DNA 結合染料，采用實(shí)時(shí)熒光定量
PCR 儀檢測熒光并完成 PCR 反應所需的熱循環(huán)，實(shí)現擴增產(chǎn)物的定量。
一步法qRT-PCR
一步法 qRT-PCR 可在同一管內完成第一鏈 cDNA 合成反應和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應，簡(jiǎn)化了反應設置，并降低了污染的可能性。需要使用基因特異性引物 (GSP)。這是由于在一步法操作中使用 oligo(dT) 或隨機引物將生成非特異性產(chǎn)物，降低了目的產(chǎn)物的量。
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