細胞培養中常見(jiàn)的污染及解決方法
關(guān)鍵詞：細胞實(shí)驗外包 細胞培養 實(shí)驗室 原代細胞 干細胞 第三方檢測機構
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細胞培養中常見(jiàn)的生物污染包括細菌污染、霉菌污染、支原體污染、黑點(diǎn)污染、真菌污染和原生動(dòng)物污染。這些污染在細胞培養中的特點(diǎn)及相應的解決辦法如下：
1.細菌污染
細菌在普通倒置顯微鏡下呈黑色和細砂狀。根據感染菌的種類(lèi)不同，可能會(huì )呈現不同的形狀，培養液一般會(huì )變得渾濁、黃色，對細胞生長(cháng)有明顯影響。
解決方法：仔細檢查器具的滅菌情況，確保通風(fēng)時(shí)間和高壓滅菌器的壓力是否足夠。最重要的是，與培養基接觸的移液管等物品如果被污染兩次，則可能會(huì )導致儲存溶液也受到污染。所以一定要注意！下次使用前要檢查培養基的渾濁度。此外，建議在培養基中添加抗生素。
2.霉菌污染
正常情況下，培養基在 37℃ 培養箱中培養兩三天，在倒置顯微鏡下仍保持透明，無(wú)雜質(zhì)。一旦出現絮狀雜質(zhì)，顯微鏡下可見(jiàn)絲狀和團塊狀漂浮物，菌絲明顯。此時(shí)，雖然細胞仍在生長(cháng)，但它們的生命狀態(tài)會(huì )在長(cháng)時(shí)間后逐漸惡化。
解決方法：用硫酸銅溶液擦拭 CO2 培養箱，向托盤(pán)中加入飽和硫酸銅或消毒后加入飽和磷酸氫二鈉高鹽溶液，避免霉菌污染。
如果霉菌污染，暫時(shí)轉移所有細胞，并立即徹底使用 guo 氧乙酸溶液擦拭培養箱，包括層板和內壁。將 guo 氧乙酸放在培養箱中一小時(shí)，使蒸汽擴散，待 guo 氧乙酸氣味消散后，將細胞轉移到培養箱中。值得注意的是，培養箱需要每?jì)蓚€(gè)月定期清洗一次，尤其是在梅雨季節。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精連續擦拭培養箱，用紫外線(xiàn)照射也是一種有效的方法。
為防止霉菌污染，需添加 3μg/ml 兩性霉素、霉素抑制素、fang 線(xiàn)菌素 D 或青霉素鏈霉素。一旦被污染，就不可能恢復，即使使用上述抗生素，也沒(méi)有什么區別。對于支原體污染的細胞培養，最好選擇是丟棄污染的培養物，并用使用新鮮的無(wú)支原體的儲存液，徹底消毒環(huán)境。如果所有的細胞都被污染了，那可能是整個(gè)培養系統污染了。因此，必須對培養基和實(shí)驗設備進(jìn)行檢查。如果只是個(gè)別污染，可能是操作問(wèn)題，有必要注意實(shí)驗操作步驟的規范。
3.支原體污染
支原體是隱蔽的污染物，不能通過(guò)過(guò)濾去除。顯微鏡下沒(méi)有任何可見(jiàn)的支原體污染跡象，比如細胞病變和濁度或 pH 值變化（即使在嚴重污染的培養基中），這樣就會(huì )導致我們產(chǎn)生錯誤的安全感。而在牛血清中，支原體是最常見(jiàn)的微生物之一。
解決方法：通常的過(guò)濾滅菌方法對支原體沒(méi)有影響。細胞一旦被支原體污染，特別是對重要的細胞系，必須去除支原體，一般的方法有抗生素治療、抗血清治療和抗血清與補體聯(lián)合治療。值得注意的是，支原體最突出的結構特征是沒(méi)有細胞壁。因此，它對作用于細胞壁的生物合成抗生素（如 β-內酰胺類(lèi)、萬(wàn)古霉素等）完全不敏感，并且通常對多粘菌素、利福平和磺胺類(lèi)藥物具有耐藥性。相反，四環(huán)素類(lèi)和大環(huán)內酯類(lèi)抗生素對支原體的抑制作用最強，而氨基糖苷類(lèi)和氯霉素的抑制作用較弱。
4.黑點(diǎn)污染
黑色的游動(dòng)點(diǎn)能穿透濾膜并在空氣中擴散。它們在低倍鏡下顯示為黑色圓點(diǎn)，在高倍鏡下顯示為可移動(dòng)的黑色斑點(diǎn)。培養液也不渾濁，一般影響較小，因此細胞仍可使用。通常，黑點(diǎn)污染后，細胞生長(cháng)良好，運動(dòng)物體無(wú)明顯增加，培養基的顏色和透明度無(wú)明顯變化。在同一批血清培養的細胞中也可以發(fā)現類(lèi)似的現象。
解決方法：黑點(diǎn)對細胞生長(cháng)狀態(tài)沒(méi)有明顯影響，細胞增殖后會(huì )自然消失，因此除了血清置換外，無(wú)需特殊處理。如果細胞可能被小的運動(dòng)點(diǎn)污染，建議增加培養皿細胞密度，以提高細胞存活率。
5.真菌污染
真菌污染后，培養基一般清澈，保持原色。細絲可以在顯微鏡下觀(guān)察到。最初，一些真菌類(lèi)似于死細胞碎片，但其中許多清晰可見(jiàn)，看起來(lái)像珊瑚，比較容易區分。此外，它們會(huì )慢慢長(cháng)出細細的黑色細絲，因為它們生長(cháng)得比較慢，不像細菌那樣容易被發(fā)現，一旦發(fā)現培養基被污染，它們將很難存活。
解決方法：一旦被真菌污染，果斷丟棄，然后對細胞房、CO2 培養箱、器皿和培養基進(jìn)行徹底消毒。
6.原生動(dòng)物污染
原生動(dòng)物污染后，細胞培養基變得輕微渾濁。在顯微鏡下，大量的小點(diǎn)來(lái)回移動(dòng)。雖然此時(shí)細胞仍能生長(cháng)，但繁殖速度減慢，細胞生長(cháng)狀態(tài)不好，邊緣不清，變得不透明。原生動(dòng)物與細胞形成共生關(guān)系。同時(shí)，原生動(dòng)物與細胞競爭營(yíng)養。這種共生現象非常普遍，但以細胞為主，因為原生動(dòng)物的數量相對較少，因而對細胞的正常生長(cháng)沒(méi)有影響，只有當它們達到一定數量時(shí)，才最終爆發(fā)成為惡性循環(huán)。
解決方法：原生動(dòng)物污染的原因有很多，如液體消毒問(wèn)題、操作問(wèn)題、環(huán)境問(wèn)題等，如果細胞足夠，果斷丟棄被污染的細胞和復蘇細胞。如果要保留，需要購買(mǎi)使用相關(guān)的滅菌試劑。
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