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手把手教你篩選與轉錄因子TF結合的共調控因子，為你的lncRNA研究思路錦上添花
以下文章來(lái)源于i生信 ，作者小堅果
近幾年長(cháng)鏈非編碼RNA（lncRNA）作為國自然申請方向中的一個(gè)火熱的研究熱點(diǎn)，通過(guò)各種數據庫，芯片，二代測序等等等，好不容易在自己研究的腫瘤里找到了一個(gè)心儀的lncRNA，驗證了一系列的表型或功能。那么接下來(lái)機制研究怎么搞呢？或許大多數人研究的方向為其找下游，比如用ChIRP-seq實(shí)驗尋找與lncRNA相互作用的DNA，或者用ChIRP-MS、體外轉錄RNA pulldown方法去尋找與lncRNA作用緊密的轉錄因子蛋白等等。其實(shí)如題，既然你的lncRNA功能這么強大，我們還可以找上游，找到調控它的TF和co-factors。下面就根據幾種不同的預測數據及實(shí)驗驗證思路對我們的文章錦上添花。
1、首先，準備數據庫。需要用到幾個(gè)數據庫，如NCBI、UCSC找啟動(dòng)子；PROMO找預測TF；The human protein atlas找蛋白定位；基于TCGA數據庫的GEPIA找目的基因生存分析及表達相關(guān)性。
2、得到基因的promotor序列：拿驅動(dòng)蛋白KTN1 DNA為例。首先，我們在UCSC genomebrowser中輸入KTN1，
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點(diǎn)擊你看的順眼的那條KTN1的轉錄本（具體怎樣選轉錄本在Uniprot上查找“canonical）”，可以看到KTN1的概述，點(diǎn)擊GenomicSequence，
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只在Promoter/Upstream位置打勾，注意Downstream不要打勾，我就吃過(guò)虧，它指的不是轉錄起始位點(diǎn)TSS的下游，而是全基因的下游??！
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點(diǎn)擊submit，返回得到KTN1的啟動(dòng)子序列。
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3、找預測轉錄因子：接下來(lái)，打開(kāi)PROMO數據庫，http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3，首先選擇左側SelectFactors，我們選擇human，點(diǎn)擊SearchSites，把剛才查找的KTN1啟動(dòng)子序列復制進(jìn)去，錯誤率設置為0，點(diǎn)擊submit。
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可以看到，KTN1 promotor的轉錄因子預測有18個(gè)。分別點(diǎn)擊進(jìn)去，可以了解預測的結合位點(diǎn)等等信息。下面就可以進(jìn)行驗證了，用IDT網(wǎng)站或者Primer 6.0軟件等進(jìn)行這18個(gè)基因的引物設計，在你收取的腫瘤組織中分別做驗證，是否正調控（一般轉錄因子都是positive的），砍掉幾個(gè)沒(méi)用的，留下有用的，再分別設計siRNA在細胞系中進(jìn)行敲低，留下對KTN1影響最明顯的那個(gè)。OK，TF選擇搞定。
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4、ChIP實(shí)驗驗證是否結合：上面假設我們最后選擇了XBP-1這個(gè)TF，可以看到，XBP-1與KTN1的預測結合位點(diǎn)在A(yíng)GTCAT，那么ChIP實(shí)驗被應用，設計包含AGTCAT序列的KTN1引物，買(mǎi)個(gè)ChIP kit檢測，很漂亮，確實(shí)有變化。之后就是通過(guò)luciferase或者EMSA套路的方法檢驗二者是否在這個(gè)結合位點(diǎn)結合，驗證完畢。
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5、與TF相互作用的共調控因子的篩選：
繼續以XBP-1為例。首先，我們用XBP-1抗體做一個(gè)CO-IP實(shí)驗，SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍染色或者銀染，銀染敏感性更高一些。切膠送去打質(zhì)譜。一般切膠回收的質(zhì)譜都只能定性不能定量。從質(zhì)譜的結果中減掉IgG背景值后篩選Fold change大于2.0以上的差異蛋白。
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下面我們來(lái)篩選最可能作用的co-factor，首先在GEPIA數據庫中輸入已經(jīng)篩出來(lái)的差異蛋白名稱(chēng)，檢測與XBP-1的相關(guān)性，以FOXP1為例，選擇Correlation輸入Gene A為XBP-1，Gene B為FOXP1，選擇你研究的腫瘤，點(diǎn)擊Plot，看，相關(guān)性數據出來(lái)了。一般我們選取R值大于30%相關(guān)系數的蛋白。
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接下來(lái)，打開(kāi)The human protein altas數據庫，搜索FOXP1及其他CO-IP出來(lái)的蛋白，可以發(fā)現FOXP1主要定位于細胞核內，so，結合與XBP-1的相關(guān)性分析，排除掉單純位于細胞質(zhì)內或細胞膜的蛋白，細胞核內的蛋白作用可能性最大。
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6、最后，CO-IP-WB驗證：按上述方法篩選出小范圍的幾個(gè)蛋白進(jìn)行WB驗證，正確位置即顯示條帶。最后，附上此co-factor肽段圖譜，加入到lncRNA機制研究中，完美5分以上文章。
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