免疫熒光法常規流程和常見(jiàn)問(wèn)題

 

A. 溶液和試劑

1. 20 X 磷酸鹽緩沖液 (PBS)： 為了制備 1 L 1 X PBS：添加 50 ml 20 X PBS 至 950 ml dH2O，然后將其混勻。注：調節 pH 至 8.0。
2. 甲醛：16%, 無(wú)甲醇，使用新鮮制劑，小瓶打開(kāi)后避光 4°C 保存。按照 1 比 4 的比例在 1X PBS 中稀釋?zhuān)瞥?4% 甲醛溶液。
3. 封閉緩沖液：（1X PBS/5% 正常血清/0.3% X-100）：準備 10 ml 緩沖液，添加 0.5 ml 與二抗同一物種來(lái)源的正常血清并混勻。攪拌時(shí)加入 30 µl Triton™ X-100。
4. 抗體稀釋緩沖液：(1X PBS/1% BSA/0.3% Triton™ X-100)：準備 10 ml 溶液，添加 30 µl  X-100 到 10 ml 1X PBS 中?；靹蚝笤偌尤?0.1g BSA，并混勻。
5. 熒光物質(zhì)標記二抗

B. 標本準備

I. 培養細胞系 (IF-IC)

注：細胞應當在多孔板、腔室玻片或蓋玻片上直接培養、處理、固定和染色。

1. 吸干液體，隨后在細胞上覆蓋一層 2–3 mm 用溫熱 PBS 稀釋的 4% 甲醛。

   注：甲醛有毒性，僅限通風(fēng)櫥中使用。

2. 室溫下固定細胞 15 分鐘。
3. 吸干固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分鐘。
4. 繼續進(jìn)行免疫染色操作（C 部分）。

II. 冰凍/低溫切片 (IF-F)

1. 冰凍固定組織進(jìn)行免疫染色（C 部分）。
2. 對新鮮未固定的冰凍組織，立刻按下列步驟固定：
   1. 將切片覆蓋一層用溫熱 1X PBS 稀釋的 4% 甲醛溶液。
   2. 室溫下固定切片 15 分鐘。
   3. 用 PBS 漂洗玻片三次，每次 5 分鐘。
   4. 繼續進(jìn)行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注：所有隨后的孵育都應當在室溫下完成，除非另外注明需要在潮濕光密盒或帶蓋的培養皿/板中孵育，以防止干燥和熒光物質(zhì)淬滅。

1. 在封閉緩沖液中封閉標本 60 分鐘。
2. 封閉標本時(shí)，按照數據表中推薦的稀釋比例，在抗體稀釋緩沖液中配制一抗。
3. 吸去封閉緩沖液，加入稀釋后的一抗。
4. 4°C 孵育過(guò)夜。

5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分鐘。

   注：如果使用熒光物質(zhì)標記的一抗，則跳轉到 Ｃ部分，第 8 步。

6. 用抗體稀釋緩沖液將熒光物質(zhì)標記的二抗稀釋后，室溫下避光孵育標本 1–2 小時(shí)。
7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分鐘。
8. 用蓋玻片蓋住切片。
9. 要達到最佳效果，使用封片液室溫過(guò)夜。將切片平放避光 4°C 環(huán)境下，可長(cháng)期保存。