關(guān)于免疫組化的常見(jiàn)問(wèn)題
關(guān)鍵詞：病理切片 組織切片 病理結果分析 免疫組化 病理組織切片 病理染色 染色結果分析
1） 產(chǎn)生組織切片非特異性染色的原因有哪些？如何解決？
1、 抗體孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)、抗體濃度高易增加背景著(zhù)色。這可通過(guò)縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是最重要的一條。
2、 一抗用多克隆抗體易出現非特異性著(zhù)色，建議試用單克隆抗體看看。
3、內源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過(guò)延長(cháng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色；
4、非特異性組分與抗體結合，這需要通過(guò)延長(cháng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當增加濃度來(lái)加強封閉效果；
5、 DAB 孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)或濃度過(guò)高；
6、 PBS 沖洗不充分，殘留抗體結果增強著(zhù)色，在一抗/二抗/SP 孵育后的浸洗尤為重要；
7、 標本染色過(guò)程中經(jīng)常出現干片，這容易增強非特異性著(zhù)色。
2） 免疫組化染色呈陰性結果的原因有哪些？
1、抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯誤。不是抗體濃度越高就越易出現陽(yáng)性結果，抗原抗體反應有前帶和 后帶效應，必須摸索最佳濃度。
2、抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來(lái)打開(kāi)抗原表位，以利于與抗體結合；建議微波修復 用高火 4 次*6min 試試。有人做過(guò)實(shí)驗，這是最佳的時(shí)間和次數。若不行，還可高壓修復。
3、組織切片本身這種抗原含量低。
4、血清封閉時(shí)間過(guò)長(cháng)。
5、DAB 孵育時(shí)間過(guò)短。
6、細胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內參與反應。
7、開(kāi)始做免疫組化，建議一定要首先做個(gè)陽(yáng)性對照片，排除抗體等問(wèn)題。
3） 石蠟切片和冰凍切片的比較？
1、要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片。因為做石蠟切片時(shí)要高溫烤片，可能會(huì )破壞組織的抗原性，如果組織 的抗原性較穩定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。
2、冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時(shí)不需抗原修復這一步。缺點(diǎn)是細胞內易 形成冰晶而破壞細胞結構，可能會(huì )使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒(méi)石蠟的漂亮。當你買(mǎi)一抗時(shí)，目 錄上都寫(xiě)著(zhù)做什么樣的切片，如果它寫(xiě)著(zhù)只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫(xiě)著(zhù)兩者都可，那就都能做。
3、石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)可以保持組織細胞的形態(tài)結構，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80 度的低溫冰箱中，尤其是用來(lái)做原位雜交的的切片，為了防止 RNA 降解，保存一貫很重要。由于石蠟切片可以切到 4 微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好。
4） 如何選擇一抗？
1、單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標明確地與單一 的特異抗原決定簇結合，就像導彈精確地命中目標一樣。另一方面，即使是同一個(gè)抗原決定簇，在機體內也可以由 好幾種克隆來(lái)產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱(chēng)為多克隆抗體。在抗原抗體反應中，一般單克隆抗體特 異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高， 但易出現非特異性染色（可以通過(guò)封閉等避免）。
2、應用范圍的選擇。有的一抗只能用于 Western blotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至標明石蠟切片或冰凍切片。
3、種屬反應性的選擇（species reactivity）。這一點(diǎn)很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測哪種種屬動(dòng)物體內的抗原。
4、種屬來(lái)源，一般兔來(lái)源的多是多克隆抗體；而小鼠來(lái)源的多是單克隆抗體，但也有另外。根據此來(lái)源來(lái)選擇相 應的二抗。
5、生產(chǎn)廠(chǎng)家的選擇。
5） 在什么情況下使用 TritonX-100？
1、Triton X-100 化學(xué)名稱(chēng)為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(xué)(>10um 厚切片) 和免疫細胞化學(xué)中一般用 Triton X-100 作為細胞通透劑，在膜上打孔。
2、其作用原理：Triton X-100 可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結構的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內，故在細胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內與相應抗原結合。
3、Triton X-100 既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。
6） 封閉血清的選擇原則是什么？
1、膜上或切片上有剩余的位點(diǎn)可以非特異性吸附抗體，造成后續結果的假陽(yáng)性。
2、封閉血清一般是和二抗同一來(lái)源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點(diǎn)發(fā)生結合，否 則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結合，會(huì )造成背景。
3、也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來(lái)源一致。
7） 抗體孵育條件的比較？
1、一抗孵育溫度有幾種：4 度、室溫、37 度，其中 4 度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般 37
度 1-2h，4 度過(guò)夜（從冰箱拿出后 37 度復溫 45min）。
2、二抗一般室溫或 37 度 30min-1h，具體時(shí)間需要摸索。
8） 一抗 4 度孵育后為什么要進(jìn)行 37 度復溫？
1、一方面，防止切片從 4 度直接放入 PBS 易脫片；
2、另一方面，使抗原抗體結合更穩定。一般不需要,但對表達較弱的抗原可能有用,4 度和 37 度時(shí)分子運動(dòng)方式不同, 前者分子碰撞機率和運動(dòng)速度小于后者,后者結合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。
9） DAB 顯色時(shí)間如何把握？
1、DAB 顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現淺棕色本底時(shí)即可沖洗；
2、DAB 顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現很深的棕褐色，這很可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)，需要下調抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；
3、此外，若很短時(shí)間就出現背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長(cháng)封閉時(shí)間；
4、DAB 顯色時(shí)間很長(cháng)（如超過(guò)十幾分鐘）才出現陽(yáng)性染色，一方面可能說(shuō)明你的抗體濃度過(guò)低或孵育時(shí)間過(guò)短（最好一抗 4 度過(guò)夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過(guò)長(cháng)。
10） 免疫組化結果如何分析？
1、陽(yáng)性著(zhù)色細胞計數法。在 40×光鏡下，隨機選擇不重疊的 10 個(gè)視野，人工或機器計數陽(yáng)性著(zhù)色細胞，每組 3~6
張不同動(dòng)物組織切片，然后進(jìn)行組間比較即可。
2、灰密度分析法。通過(guò)在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇相同區域、相同條件下用 image j 進(jìn)行灰密度分析， 然后進(jìn)行統計分析即可。
3、評分法。通過(guò)在光學(xué)顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0~3 分為陰性著(zhù)色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽(yáng)性范圍進(jìn)行評分（1~4 分為 0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最終可以分數相加，再進(jìn)行比較。
對于以上這幾種方法，各有利弊，請細心選擇。要想得到正確結果的前提是你要做出著(zhù)色均勻、背景很淺的高質(zhì)量 切片。
11） 在什么情況下進(jìn)行組織抗原修復？
1、由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過(guò)程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。 通過(guò)抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。
2、修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。修復液也分為若干種（具體的可以查閱相 關(guān)資料，大量的：中性的、高 pH 的等）。
3、微波修復，一般用 6min*4 次，效果不錯。
12） 內源性過(guò)氧化物酶的滅活時(shí)間和濃度是什么？
1、一般 3%過(guò)氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以 10min 左右；而 0.3%過(guò)氧化氫則可以適當延長(cháng)封閉時(shí)間，一般 10~30min。
2、用甲醇配置過(guò)氧化氫比雙蒸水或 PBS 可能好在保護抗原和固定組織作用，過(guò)氧化氫孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)易引起脫片.
3、現用現配，配好后 4 度避光保存。
13） 如何才能充分脫蠟？
1、蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會(huì )引起染色不均勻、陽(yáng)性物時(shí)隱時(shí)現、真假難辨、背 景染色增加等。為了解決上述的問(wèn)題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟 力強，脫蠟時(shí)間較短；
2、脫蠟的時(shí)間要根據季節，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟 時(shí)間不需很多，3-5 分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時(shí)間需要延長(cháng)，10-20 分鐘或更長(cháng)。
3、當天切的切片，燒烤 2 小時(shí)后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加速脫蠟的過(guò)程，如果預先切好烤好的
切片，在染色前，還必須對切片進(jìn)行加溫 10-20 分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果魁偉更好。
總之，操作時(shí)應根據不同的季節，不同的室溫，不同的試劑來(lái)決定，脫蠟的時(shí)間，原則上是要徹底、干凈、完全地 脫去切片上的蠟。
14） 如何最大限度地降低組織非特異性染色？
1、縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是最重要的一條。
2、一抗用多克隆抗體易出現非特異性著(zhù)色，建議試用單克隆抗體看看。
3、內源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過(guò)延長(cháng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色；
4、非特異性組分與抗體結合，這需要通過(guò)延長(cháng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當增加濃度來(lái)加強封閉效果；
5、縮短 DAB 孵育時(shí)間或降低 DAB 濃度/過(guò)氧化氫濃度等；
6、適當增加 PBS 沖洗次數和浸洗時(shí)間，在一抗、二抗或 SP 孵育之后的浸洗尤為重要；
7、防止標本染色過(guò)程中出現干片，這容易增強非特異性著(zhù)色。
15） 背景染色較深的原因有哪些？
1、抗體濃度過(guò)高：一抗濃度過(guò)高是常見(jiàn)的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應當對其工作濃度進(jìn)行測試， 使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應如此，不能只簡(jiǎn)單的按說(shuō)明書(shū) 進(jìn)行染色。
2、抗體孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)或溫度較高：解決辦法是，嚴格執行操作規程，最好隨身佩帶報時(shí)表或報時(shí)鐘，及時(shí)提醒， 避免因遺忘而造成時(shí)間延長(cháng)?，F在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統的 1 小時(shí)， 而是 30 分鐘，因此，要根據染色結果進(jìn)行調整。
3、DAB 變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(cháng)：DAB 最好現用現配，如有沉渣應進(jìn)行過(guò)濾后再用。配制好的 DAB 不應存放時(shí)間太長(cháng)， 因為在沒(méi)有酶的情況下，過(guò)氧化氫也會(huì )游離出氧原子與 DAB 產(chǎn)生反應而降低 DAB 的效力，未用完的 DAB 存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節約的辦法是不可取的。DAB 的顯色最好在顯微鏡下監控，達到理想的染色程度時(shí)立即終止反應。不過(guò)當染色片太多時(shí)或用染色機時(shí)，這樣做似乎不現實(shí)，但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監 控，避免顯色時(shí)間過(guò)長(cháng)。
4、組織變干：修復液溢出后未及時(shí)補充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變 干的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用 DAKO 筆或 PAP Pen 在組織周?chē)?huà)圈，可以有效的避免液體流失， 也能提高操作速度。
5、切片在緩沖液或修復液中浸泡時(shí)間太長(cháng)（大于 24 小時(shí)）：原因上不清楚，但現象存在。有的實(shí)驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復液的容器放在 4ºC 冰箱過(guò)夜，對結果無(wú)明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會(huì )出現背景著(zhù)色，因此，不可存放時(shí)間太長(cháng)。
6、一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過(guò)期的抗體要么不顯色要么背景著(zhù)色。用新買(mǎi)抗體時(shí)最 好設立陽(yáng)性對照和用使用過(guò)的抗體作比較。
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