常見(jiàn)問(wèn)題解答

免疫共沉淀檢測（Co-IP）常見(jiàn)問(wèn)題

關(guān)鍵詞：分子生物學(xué)    實(shí)驗室   免疫共沉淀  免疫沉淀  分子檢測  Co-IP檢測  第三方檢測機構

1、免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗目的蛋白高背景產(chǎn)生的原因及處理方法?

目的蛋白高背景產(chǎn)生的原因有很多種，比如：
(2)有非特異性蛋白結合
(2)轉移膜上的非特異性吸附
針對有非特異性蛋白結合這種情況，我們可以在無(wú)血清培養液中裂解細胞，而對于轉移摸上的非特異性吸附，我們就要注意實(shí)驗的操作問(wèn)題，一定要戴手套，用鑷子夾取，以及不接觸轉移膜轉移面。

2、免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗失敗的原因及處理方法。

答：（1）樣品被蛋白酶降解，應對措施：裂解樣品中加入蛋白酶抑制劑，注意冰上操作，避免反復凍融；
（2）抗體濃度太低，應對措施：調整抗體濃度，必要時(shí)設立濃度梯度，摸索最佳濃度；
（3）抗體親和力低，應對措施：先用合適的抗體；
（4）IP抗體未與agarose珠子結合，應對措施：選用合適的agarose珠子，正確保存防止變質(zhì)或干燥；
（5）Tag未暴露在融合蛋白構象的表面，應對措施：改變融合變大部位；
（6）裂解液嚴謹度太高，應對措施：改用低嚴謹度的裂解液。

3、免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗成敗的關(guān)鍵在哪里？

答：實(shí)驗最需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)。尤其是多抗的特異性是問(wèn)題；
為防止蛋白的分解、修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗；
考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過(guò)少就不能檢出抗原，過(guò)多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過(guò)多則抗原被稀釋?zhuān)?br style="box-sizing: border-box; touch-action: pan-y;" /> 確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發(fā)生的，這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。

4、免疫共沉淀（Co-IP）中抗體怎么選擇？

	多克隆抗體	單克隆抗體	單克隆抗體群（由一個(gè)免疫原產(chǎn)生的多個(gè)單克隆抗體混合物）
抗體抗原信號強度	極佳	由抗體的親和力決定（極佳或者極弱）	極佳
特異性	通常很好，但有時(shí)會(huì )有非特異性相互作用	極佳，但有時(shí)會(huì )有交叉反應	極佳（由于選擇可以進(jìn)行IP且沒(méi)有交叉反應的抗體組成單克隆抗體群）
優(yōu)點(diǎn)	親和力高（由于抗體可以與目的蛋白的多個(gè)抗原決定簇相互作用）	特異性好，且可以無(wú)限量供應	特異性好，親和力高（由于選擇可以進(jìn)行IP且沒(méi)有交叉反應的抗體組成單克隆抗體群）
缺點(diǎn)	非特異性相互作用很難去除	需要篩選親和力高的抗體；抗原表位可能會(huì )被相互作用蛋白遮蔽	能夠篩選得到的符合條件的單克隆并不多，所以單克隆抗體群也就不容易獲得
免疫沉淀效果	極佳（由于親和力高）	由抗體的親和力決定（極佳或極弱）	極佳（由于選擇可以成功進(jìn)行IP且沒(méi)有交叉反應的抗體組成單克隆抗體群）
免疫共沉淀效果	通常很好，但有時(shí)非特異性相互作用會(huì )帶來(lái)假陽(yáng)性	有抗體的親和力決定和抗原表位是否被相互作用蛋白遮蔽決定（極佳或極弱）	極佳（由于選擇可以成功進(jìn)行IP且沒(méi)有交叉反應的抗體組成單克隆抗體群）
染色質(zhì)免疫沉淀效果	通常很好，但有時(shí)非特異性相互作用會(huì )帶來(lái)假陽(yáng)性	由抗體的親和力決定和抗原表位是否被遮蔽或者以及抗原表位是否被交聯(lián)實(shí)驗所破壞決定（極佳或極弱）	極佳（由于選擇可以成功進(jìn)行IP且沒(méi)有交叉反應的抗體組成單克隆抗體群）

5、Co-IP實(shí)驗中沒(méi)有檢測到與目的蛋白相互作用的蛋白或檢測得到的信號太弱？

答：裂解液中去垢劑濃度過(guò)高或者配方太強烈；
蛋白和蛋白之間的相互作用太弱或不穩定。

6、IP 和 CoIP有什么區別？

答：IP是在已知一種蛋白質(zhì)的抗體情況下，直接用這種抗體將目標蛋白質(zhì)提取出來(lái)，是一種提純蛋白質(zhì)的方法。
免疫共沉淀（Co-IP）主要用于檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間連接作用，如你想檢測蛋白質(zhì)A與蛋白質(zhì)B之間是否有相互作用，你手中又有蛋白質(zhì)A的特異抗體，就將蛋白質(zhì)A和抗體加入到含有蛋白質(zhì)B的細胞解液中去，利用抗體提純，如果蛋白質(zhì)A，B之間有相互作用，則最后提純產(chǎn)物是抗體——蛋白質(zhì)A——蛋白質(zhì)B。由于最后終產(chǎn)物是多種蛋白質(zhì)復合物，所以這種技術(shù)叫做co-immunoprecipitation，和IP的用途區別還是很大的。

7、免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗如何避免假陽(yáng)性？

答：若抗體濃度過(guò)高，則降低抗體濃度；若抗體特異性不好，則更換抗體。

8、實(shí)驗對照的設置：

答：樣品的陽(yáng)性對照（input），抗體的陰性對照（同一種屬的IgG）

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