什么是ChIP 檢測？
關(guān)鍵詞：分子生物學(xué) 實(shí)驗室 染色質(zhì)免疫共沉淀 免疫沉淀 分子檢測 第三方檢測機構
染色質(zhì)免疫共沉淀 (ChIP, Chromatin immunoprecipitation)，是一種反映活細胞內蛋白質(zhì)-DNA 相互作用的方法。蛋白質(zhì)-DNA 復合物交聯(lián)固定后，將染色質(zhì)隨機打斷成片段，利用免疫學(xué)方法，將帶有目標蛋白的復合物特異性地沉淀、富集下來(lái)，通過(guò)對復合物中 DNA 片段的純化與檢測，可以獲得蛋白質(zhì)與 DNA 相互作用的信息。一些非常穩定的相互作用則不需要交聯(lián)。
ChIP 與其它方法結合，擴大了其應用范圍。與實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 結合的 ChIP-qPCR，常用于檢測蛋白質(zhì)與特定位點(diǎn)的 DNA 是否有結合及結合的強度；與基因芯片結合的 ChIP-on-chip，廣泛應用于特定靶標的高通量篩選；與高通量測序結合的 ChIP-seq，越來(lái)越多地被用于分析目標蛋白的全基因組結合情況。
交聯(lián)染色質(zhì)免疫共沉淀 (Crosslinked ChIP, XChIP)
需要交聯(lián)固定，一般使用甲醛，適用于結合力較弱的蛋白質(zhì)- DNA 相互作用的研究。
自然染色質(zhì)免疫共沉淀 (Native ChIP, NChIP)
不需要交聯(lián)固定，適用于結合穩定的蛋白質(zhì)- DNA 相互作用（如組蛋白修飾）的研究。
圖1. XChIP 與 NChIP 的流程概述 (王泓力 & 焦雨鈴., 植物學(xué)報, 2020[1])
優(yōu)勢
XChIP 在活細胞狀態(tài)下就將蛋白質(zhì)與 DNA 固定，更真實(shí)地反應二者之間結合的情況，比體外研究蛋白質(zhì)-DNA 相互作用的方法更好。
與其它方法的靈活結合，可以分析蛋白質(zhì)-DNA 相互作用的強度，還能夠得到目標蛋白在全基因組上的所有結合信息。
文獻
2020 年，Molecular Cell 雜志發(fā)表的研究論文 Opposing Functions of BRD4 Isoforms in Breast Cancer[2].
1. 文獻主要結論
BRD4 (Bromodomain-containing protein 4) 蛋白是正在進(jìn)行的臨床試驗中癌癥治療靶點(diǎn)之一，文章使用 RNA-seq, ChIP-qPCR, ChIP-seq, 和 CUT&RUN 等方法證實(shí)在乳腺癌中，BRD4 短亞型 (BRD4-S) 是致癌的；而 BRD4 長(cháng)亞型 (BRD4-L) 則具有相反的作用，能夠抑制腫瘤形成和轉移。并進(jìn)一步確認 EN1 (Engrailed-1) homeobox 轉錄因子是關(guān)鍵的 BRD4-S 共調節因子，尤其表現在三陰性乳腺癌中。BRD4-S 和 EN1 通過(guò)調節癌癥相關(guān)基因和通路的增強子，以共同調節細胞外基質(zhì) (ECM) 相關(guān)的網(wǎng)絡(luò )。因此，文章強調了針對 BRD4 的靶向治療應該更加特異性地針對 BRD4-S 的致癌活性而不是抑癌活性。
2. 研究結果
針對乳腺癌中 BRD4 不同亞型的抗體設計及其表達豐度檢測
圖2. BRD4 結構域組成的圖示與所設計抗體的靶向位點(diǎn)(a)，TCGA 公共數據庫中乳腺癌患者組織內 BRD4 亞型的 mRNA 表達水平(b)
體內實(shí)驗探究 BRD4-S 與 BRD4-L 的作用
圖3. 小鼠體內實(shí)驗驗證 BRD4-S 具有促進(jìn)腫瘤生長(cháng)和轉移的作用，而 BRD4-L 則相反
ChIP-qPCR 實(shí)驗驗證目標蛋白與目標 DNA 區域的結合
圖4. ChIP-qPCR 實(shí)驗驗證 BRD4 的不同亞型與 EN1 結合位點(diǎn)的相互作用；以及 EN1, BRD4-S, BRD4-L, 重要組蛋白修飾, dCas9-KRAB 之間的聯(lián)系，提出了通路模型。
ChIP-seq 實(shí)驗在全基因組范圍內描述 BRD4 與 EN1 的相互作用
圖5. 全基因組 ChIP-seq 分析 BRD4 不同亞型與 EN1 在啟動(dòng)子，增強子等區域的結合，以及它們的共同結合位點(diǎn)
文章通過(guò)結合 RNA-seq，ChIP-qPCR，ChIP-seq 等實(shí)驗方法，檢測了正常上皮細胞和不同乳腺癌中的內源性 BRD4 蛋白亞型，發(fā)現 BRD4-S 和 BRD4-L 在乳腺腫瘤進(jìn)展期間各自具有獨特甚至相反的生物學(xué)功能作用。BRD4-S 促進(jìn)癌細胞生長(cháng)和轉移；相反，BRD4-L 抑制腫瘤進(jìn)展并限制癌細胞轉移到某些器官/組織的轉移潛能，部分是因為它在生長(cháng)因子誘導的細胞遷移和腫瘤干細胞的增殖中表現出抑制作用。BRD4-S 與 EN1 相互作用，以激活 ECM 相關(guān)的基質(zhì)網(wǎng)絡(luò )，從而為腫瘤進(jìn)展提供適當的腫瘤微環(huán)境。
ChIP是一種穩定，可靠，應用十分普遍的鑒定活細胞內蛋白質(zhì)-DNA相互作用的方法，不僅適用于基因組上特定位點(diǎn)的檢測，也適用于全基因組范圍的描述，還可以用于大量樣本的高通量檢測?？梢詮V泛應用于細胞內新通路的篩選和鑒定，以及新機制的發(fā)現。
參考文獻
[1] 王泓力, & 焦雨鈴. (2020). 染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗方法. 植物學(xué)報(4).
[2] Wu, S. Y. , Lee, C. F. , Lai, H. T. , Yu, C. T. , & Chiang, C. M. . (2020). Opposing functions of brd4 isoforms in breast cancer. Molecular Cell, 78(6).
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