關(guān)于siRNA 轉染
關(guān)鍵詞：細胞實(shí)驗外包 細胞培養 實(shí)驗室 細胞轉染 質(zhì)粒轉染 脂質(zhì)體轉染 第三方檢測機構
什么是 RNA 干擾？
RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是近年來(lái)生命科學(xué)領(lǐng)域最為重大的發(fā)現之一。它是指小分子雙鏈 RNA 可以特異性地降解同源 mRNA，從而抑制或關(guān)閉特定基因表達的現象。只要知道了某種疾病的致病基因，就可以設計出針對該基因 mRNA 的小分子干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA），抑制或封閉該致病 mRNA 的表達。siRNA 是目前最為熱門(mén)的生命科學(xué)研究領(lǐng)域之一，也是未來(lái)最有發(fā)展前途的新藥開(kāi)發(fā)領(lǐng)域。siRNA 轉染實(shí)驗逐漸成為生命科學(xué)研究中常見(jiàn)手段。
siRNA轉染的特點(diǎn)
因為 siRNA 與 DNA 表面均呈現負電荷，自身無(wú)法內吞進(jìn)入細胞，所以要將 siRNA 轉染進(jìn)入細胞理論上也可采取以下幾種方法：化學(xué)轉染、電穿孔、磷酸鈣共沉淀、顯微注射等方法，其中化學(xué)轉染技術(shù)是目前最為常用的方法。而化學(xué)轉染試劑又可分為脂質(zhì)體、聚合物、多肽及其他各種納米材料，各種轉染試劑雖然材料不同，但是作用機制上卻并無(wú)區別，均采用電荷吸附作用裝載核酸，將核酸轉染進(jìn)入細胞。
siRNA 通常是一段長(cháng) 20-25 個(gè)核苷酸的雙股 RNA（dsRNA），雖然與質(zhì)粒一樣都是核酸但是卻有很大不同：第一，結構大小上有很大差別，質(zhì)粒往往有數千個(gè)堿基對而 siRNA 一般只有 21 個(gè)堿基對，相差數百倍；第二，結構穩定性上有很大不同，siRNA 作為核糖核苷酸比脫氧核糖核苷酸更容易被降解，極不穩定；第三，siRNA 與質(zhì)粒在轉染實(shí)驗中的發(fā)揮作用的位置不同，siRNA 要在細胞質(zhì)中發(fā)揮作用。這些區別導致 siRNA 的轉染實(shí)驗不能盲目照搬質(zhì)粒轉染實(shí)驗的經(jīng)驗，轉染方法、轉染試劑等都需要根據 siRNA 的特點(diǎn)來(lái)選擇。
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DNA |
siRNA |
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堿基對 |
數千 |
~21 |
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穩定性 |
較穩定 |
穩定性較差，極易被RNA酶降解 |
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作用部位 |
細胞核 |
細胞質(zhì) |
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轉染試劑作用原理 |
靜電作用 |
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轉染試劑電荷強度 |
較強 |
較弱 |
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轉染效率分析 |
熒光顯微鏡 |
qPCR |
siRNA 轉染試劑與 DNA 轉染試劑是否通用？
因為上述 siRN A與 DNA 在結構上以及作用機制上的巨大區別，所以 DNA 和 siRNA 的轉染試劑并不通用，DNA 轉染試劑（比如Lipofectamine 2000，Lipofectamine 3000）可以在一定程度上進(jìn)行 siRNA 的轉染，但是其效果無(wú)法達到最佳。為了充分包裹分子量較大的 DNA，DNA 轉染試劑一般電荷強度極高，而這種高電荷強度的試劑在進(jìn)行 siRNA 轉染時(shí)將導致 siRNA 無(wú)法從轉染試劑中完全釋放出來(lái)以至于不能充分發(fā)揮作用（即使 siRNA 已經(jīng)進(jìn)入細胞）；其次，這種高電荷強度也會(huì )給細胞帶來(lái)一定的毒性。所以 Lipo2000、Lipo3000 等產(chǎn)品雖然可以實(shí)現 siRNA 和 DNA 的共轉染，但是對于單獨 siRNA 的轉染并不是最佳選擇，InvitroRNA™ 等 RNA 專(zhuān)用轉染試劑對細胞更佳溫和、轉染效率更高，顯著(zhù)優(yōu)于 lipo2000 等產(chǎn)品（如下圖）。
siRNA 轉染效率的檢測方法
轉染效率的確定，最可靠最精確的方法無(wú)疑是檢測目的基因的 mRNA 水平。有些初學(xué)者習慣使用熒光顯微鏡來(lái)判斷轉染效率，這其中存在諸多問(wèn)題。采用熒光觀(guān)察 siRNA 的轉染往往是在 siRNA 上標記熒光分子，這至少存在三個(gè)誤區：一是熒光顯微鏡看到的熒光強度不能代表進(jìn)入細胞的 siRNA 的量，因為非特異性吸附在細胞表面的 siRNA 也同樣發(fā)光；二是進(jìn)入細胞的 siRNA 與轉染效率并不直接相關(guān)，有些轉染試劑能夠將 siRNA 轉入細胞，但不能充分釋放，導致基因抑制效率并不高；三是熒光基團修飾的 siRNA 與未修飾的 siRNA 是兩個(gè)不同的分子，熒光基團引起 siRNA 分子性質(zhì)發(fā)生變化，導致轉染效率可能存在差別。所以不能簡(jiǎn)單的僅靠觀(guān)察熒光顯微鏡判斷轉染效率、選擇轉染試劑，這往往會(huì )導致誤判，影響實(shí)驗的進(jìn)展。
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