細胞凍存有哪些注意事項？
關(guān)鍵詞：細胞實(shí)驗外包 細胞培養 實(shí)驗室 細胞培養 干細胞 細胞檢測 第三方檢測機構
細胞培養的傳代及日常維持過(guò)程中，在培養器具、培養液及各種準備工作方面都需大量的耗費，而且細胞一旦離開(kāi)活體開(kāi)始原代培養，它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著(zhù)傳代次數的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時(shí)進(jìn)行細胞凍存十分必要。細胞冷凍儲存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;細胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時(shí)間是無(wú)限的。
細胞凍存的步驟：
配制含 10%DMSO 或甘油、10~20% 小牛血清的凍存培養液;
取對數生長(cháng)期的細胞，去除舊培養液，用 PBS 清洗。
去除 PBS，加入適量胰蛋白酶 (覆蓋培養皿表面) 把單層生長(cháng)的細胞消化下來(lái);
離心 1000rpm，5min;
去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節凍存液中細胞的最終密度為 5×106/ml~1×107/ml;
將細胞分裝入凍存管中，每管 1~1.5 ml;
在凍存管上標明細胞的名稱(chēng)，凍存時(shí)間及操作者;
凍存:標準的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/ min;當溫度達-25℃以下時(shí)，可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱 2h ，然后放入-70℃冰箱中過(guò)夜，取出凍存管，移入液氮容器內。
關(guān)于細胞凍存的注意事項：
1. 為保持細胞最大存活率，一般都采用慢凍存融的方法。
2. 凍存物距液氮面越近溫度越低。標準的低凍速度為－1℃~12℃/ 分鐘，當溫度下降達－25℃時(shí)，下降速度可增至－5~－10℃/ 分鐘，到－100℃時(shí)則可迅速凍入液氮中。因此要適當掌握凍存物下降入液氮中的速度，過(guò)快能影響細胞內水分透出，太慢則促冰晶形成。
3. 初次凍存者在下降凍存時(shí)，宜先用細木棒伸入罐中探測液面位置，然后需用溫度計與凍存物并行的辦法，以觀(guān)測下降凍存物的速度、凍存物與液氮液面距離和溫度三者關(guān)系，當已掌握以上各參數和凍存技術(shù)熟練后，僅按下降時(shí)間和下降距離便可獲理想凍存效果。
4. 各種細胞對凍存速度的要求也不一樣；上皮細胞和成纖維細胞耐受性可能大些，骨髓干細胞－2~－3℃/ 分鐘合適；胚胎細胞耐受性較小，不宜太快?？傊谝婚_(kāi)始時(shí)，下降速度不能超過(guò)－10℃/ 分鐘。
5. 用什么防護劑合適和用量多大，要依細胞而定，初代培養細胞用 DMSO 較好，一般細胞可用甘油；用量以較小為好。有人認為人皮膚上皮細胞貯存在 20%-30% 甘油中很好。
6. 原則上細胞在液氮中可貯存多年，但為妥善起見(jiàn)，凍存一年后，應再復蘇培養一次，然后再繼續凍存。
7. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護工作，以免凍傷
8. 注意自身的安全，對于來(lái)自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心。操作過(guò)程中，應避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑例如 DMSO，并避免尖銳物品傷人等。
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