樣本準備、包裝、保存和運輸指南
1 樣本準備應該遵循的基本原則
1.1 代表性原則
取樣的代表性關(guān)系到實(shí)驗結果是否具有科學(xué)意義，因此您應該根據實(shí)驗目的慎重選擇您的取樣方案。病變組織樣本中應不夾帶正常組織，正常組織樣本中不能含有病變組織。有條件時(shí)，應做到實(shí)驗組與對照組的樣本在取材時(shí)間、部位、處理條件等方面盡可能保持一致，否則可能會(huì )影響實(shí)驗結果的可信度。
1.2 準確性原則
代表性樣本的各種特征數據必須被準確記錄，并按要求（低溫、迅速）采集、制備、貯存、運輸，最終正確地按實(shí)驗設計進(jìn)行實(shí)驗和數據處理。
1.3 迅速性原則
樣本質(zhì)量是實(shí)驗中影響實(shí)驗結果的最關(guān)鍵因素，因此樣本在采集、制備、貯存、
運輸過(guò)程中應盡可能地做到迅速，最大限度的縮短從樣本采集到實(shí)驗的時(shí)間。
1.4 低溫原則
所取樣本離體后，應盡快置于液氮、干冰或-80℃冰箱中，并保證在實(shí)驗前始
終處于-70℃以下，以避免DNA/RNA的降解。
2 樣本準備的方法
2.1 貼壁細胞
2.1.1RNA
2.1.1.1 貼壁細胞培養誘導結束后，去除培養液；
2.1.1.2 加入適量的PBS緩沖液沖洗一次，徹底去除PBS緩沖液
2.1.1.3 按每10 cm2 （相當于六孔板一個(gè)孔或35mm直徑培養皿）細胞加
1mL TRIzol 試劑的比例加入TRIzol 試劑；
2.1.1.4 使用玻璃滴管（或移液器Tip頭）反復吹打細胞，直至看不見(jiàn)成團的
細胞塊，使之充分溶解于TRIzol 中形成清亮不粘稠的液體；
2.1.1.5 將TRIzol液體全部轉移到RNase-free 的試管中
2.1.1.6 放入-80℃冰箱中保存。
2.1.2miRNA
2.1.2.1 貼壁細胞培養誘導結束后，去除培養液；
2.1.2.2 加入適量的PBS緩沖液沖洗一次，徹底去除PBS緩沖液；
2.1.2.3 按每105-107的細胞加入600μl Lysis/Binding Solution（我公司可免
費提供）；
2.1.2.4 使用移液器Tip頭反復吹打細胞，直至看不見(jiàn)成團的細胞塊，使之充
分溶解于裂解液中形成清亮不粘稠的液體；
2.1.2.5 將液體全部轉移到RNase-free 的試管中；
2.1.2.6 放入-80℃冰箱中保存。
2.1.3 DNA
2.1.3.1 胰酶消化并收集約1-4×106細胞（60mm培養皿或T25培養瓶），轉
移到1.5ml離心管中；
2.1.3.2 3000rpm離心5min，去胰酶；
2.1.3.3 PBS輕輕吹打清洗一次。 3000rpm離心5min，去上清；
2.1.3.4 放入-80℃冰箱中保存。
2.1.4蛋白
2.1.4.1 貼壁細胞培養誘導結束后，去除培養液；
2.1.4.2 加入適量的PBS緩沖液沖洗一次，徹底去除PBS緩沖液
2.1.4.3 按六孔板一個(gè)孔或35mm直徑培養皿細胞加200µL TRIzol 試劑的比例加入RIPA 試劑；
2.1.4.4 使用玻璃滴管（或移液器Tip頭）反復吹打細胞，直至看不見(jiàn)成團的細胞塊，使之充分溶解于RIPA中形成清亮不粘稠的液體；
2.1.4.5 將液體全部轉移到離心管中；
2.1.4.6 放入-80℃冰箱中保存。
2.2 懸浮細胞
2.2.1RNA
2.2.1.1 懸浮細胞培養誘導結束后，去除培養液；
2.2.1.2 保留的細胞用PBS 緩沖液快速洗一次，離心除去PBS 緩沖液；
2.2.1.3 按照每5×106 個(gè)細胞加1 mL TRIzol 的比例加入TRIzol 試劑，使用
玻璃滴管（或移液器Tip頭）反復吹打細胞直至看不見(jiàn)成團的細胞
塊，使之充分溶解于TRIzol 中形成清亮不粘稠的液體；
2.2.1.4 放入-80℃冰箱中保存。
2.2.2miRNA
2.2.2.1 懸浮細胞培養誘導結束后，去除培養液；
2.2.2.2 保留的細胞用PBS 緩沖液快速洗一次，離心除去PBS 緩沖液；
2.2.2.3 按照每105-107的細胞加入600μl Lysis/Binding Solution（我公司可免費提供）；
2.2.2.4 使用移液器Tip頭反復吹打細胞，直至看不見(jiàn)成團的細胞塊，使之充分溶解于裂解液中形成清亮不粘稠的液體；
2.2.2.5 將液體全部轉移到RNase-free 的試管中；
2.2.2.6 放入-80℃冰箱中保存。
2.2.3DNA
2.2.3.1 收集約1-4×106細胞（60mm培養皿或T25培養瓶），轉移到1.5ml離心管中；
2.2.3.2 3000rpm離心5min；
2.2.3.3 PBS輕輕吹打清洗一次。 3000rpm離心5min，去上清；
2.2.3.4 放入-80℃冰箱中保存。
2.2.4蛋白
2.2.4.1 貼壁細胞培養誘導結束后，去除培養液；
2.2.4.2 加入適量的PBS緩沖液沖洗一次，徹底去除PBS緩沖液
2.2.4.3 按六孔板一個(gè)孔或35mm直徑培養皿細胞加200µL TRIzol 試劑的比例加入RIPA 試劑；
2.2.4.4 使用玻璃滴管（或移液器Tip頭）反復吹打細胞，直至看不見(jiàn)成團的細胞塊，使之充分溶解于RIPA中形成清亮不粘稠的液體；
2.2.4.5 將液體全部轉移到離心管中；
2.2.4.6 放入-80℃冰箱中保存。
2.3 全血
2.3.1RNA
2.3.1.1 抽提RNA建議采用BD的PAXgene管抽取全血。使用淋巴細胞分離液或紅細胞裂解液會(huì )使活細胞處于應激狀態(tài)，從而影響細胞的基因表達；
2.3.1.2 PAXgene管抽取全血；
2.3.1.3 采血以后，顛倒混勻8-10次；
2.3.1.4 4℃放置過(guò)夜后轉入-20℃或-80℃冰箱中保存。
2.3.2 DNA
2.3.2.1 用EDTA抗凝管抽取1-2ml全血；
2.3.2.2 顛倒混勻抗凝管8-10次，充分混勻EDTA和全血，保證抗凝效果；
2.3.2.3 放入-20℃冰箱中保存。
2.4 血漿
2.4.1 采集外周血2mL，迅速轉入EDTA抗凝管中，渦旋或用移液器Tip混勻；
2.4.2 在1小時(shí)（室溫條件下）或2小時(shí)(4℃條件下)內進(jìn)行下面的操作： 4℃，820g（9,400rpm）離心10分鐘；
2.4.3 吸約1mL上清轉至潔凈的1.5 mL離心管中，16,000g (13,200rpm),4℃,離心10分鐘，小心吸取上清到新的離心管中；
2.4.4 放入-80℃冰箱中保存。
2.5血清
2.5.1采集外周血2mL，迅速轉入促凝管中，渦旋或用移液器Tip混勻；
2.5.2 放入冰箱4℃條件下凝固4h，4℃，3000rpm離心10分鐘；
2.5.3 將上清轉至潔凈的1.5 mL離心管中，16,000g (13,200rpm),4℃,離心10分鐘，小心吸取上清到新的離心管中；
2.5.4 放入-80℃冰箱中保存。
2.6 動(dòng)物組織
2.6.1 RNA， miRNA、 DNA、蛋白和病例檢測
2.6.1.1首先準備好用于包裝樣本冷凍保存管，并且用油性記號筆在凍存管外表多處寫(xiě)明樣本編號；
2.6.1.2動(dòng)物取材時(shí)：
病理樣本：10%福爾馬林的全身灌流，沖出待檢測樣本中的血液；
電鏡樣本：用生理鹽水全身灌流，沖出待檢測樣本中的血液；
RNA， miRNA、 DNA、蛋白檢測樣本：用生理鹽水全身灌流，沖出待檢測樣本中的血液；
準確切除所需組織后，立即剔除結締組織和脂肪組織等非研究所需的組織。務(wù)必將組織分割成小塊；
2.6.1.3 在生理鹽水或PBS中迅速漂洗樣本，以去除血漬和污物；
2.6.1.4 用鑷子夾住樣本，放入液氮中冷卻樣本（病理檢測的組織需置入4%多聚甲醛固定，電鏡樣本置于2.5%的戊二醛4℃固定）；
2.6.1.5 放入準備好的保存管中根據實(shí)驗目的不同條件保存；
2.6.1.6 填寫(xiě)樣本登記單，寫(xiě)明樣本名稱(chēng)、組織類(lèi)型、編號、取樣日期、樣本處理過(guò)程等情況。
2.7 臨床組織標本
2.7.1RNA， miRNA、 DNA、蛋白和病理檢測
2.7.1.1 首先準備好用于包裝樣本冷凍保存管，并且用油性記號筆在凍存管外表多處寫(xiě)明樣本編號；
2.7.1.2 準確切除所需組織后，立即剔除非研究所需的組織，并將組織分割成小塊；
2.7.1.3 用鑷子夾住樣本，放入液氮中冷卻樣本（病理檢測的組織需置入4%多聚甲醛固定，電鏡樣本置于2.5%的戊二醛4℃固定）；
2.7.1.4 放入準備好的保存管中根據實(shí)驗目的不同條件保存；
2.7.1.5 填寫(xiě)樣本登記單，寫(xiě)明樣本名稱(chēng)、組織類(lèi)型、編號、取樣日期、樣本處理過(guò)程等情況。
3 樣本包裝
3.1 注意事項
3.1.1在包裹樣本的鋁箔或冷凍保存管表面，用油性記號筆標明樣本編號及樣本
類(lèi)型。并且不要與乙醇等有機溶劑接觸。
3.1.2不要用紗布、紙張、一次性手套直接包裹樣本，而是用鋁箔或冷凍保存管包裹后再裝入樣本袋中。
3.1.3不要用玻璃容器在液氮中保存樣本；樣本包裝中不要使用透明膠帶。
3.1.4不要把標簽紙或其他紙制的說(shuō)明性文件放入樣本袋內，因為紙張在液氮中
是易碎的。
3.1.5標簽紙應該貼于樣本袋繩上，不要貼于容器表面以免脫落造成樣本混亂。
3.1.6不要在一只樣本袋中放過(guò)多的樣本，以防無(wú)法放入液氮罐或無(wú)法從液氮罐
中取出。樣本袋在使用前先在液氮中預冷。
3.1.7客戶(hù)在填寫(xiě)《樣本登記單》時(shí)應當詳細描述樣本的類(lèi)型、處理方法、儲存條件以及儲存時(shí)間等相關(guān)細節，以便技術(shù)人員確定合理的實(shí)驗方案。
4 樣本儲存
4.1 樣本冷凍儲存
4.1.1組織樣本采集后，樣本迅速放入進(jìn)口高質(zhì)量?jì)龃婀苤?，擰緊后立即放入液氮。然后再轉移到-80℃中保存。
4.1.2組織樣本儲存于液氮或-80℃冰箱中。對于液氮保存樣本，務(wù)必注意， 不要用Eppendorf管和國產(chǎn)凍存管，因為這些管子從液氮中取出時(shí)極易發(fā)生管子爆裂而造成樣本損失。
4.1.3細胞樣本經(jīng)Trizol或RIPA處理后儲存于-80℃冰箱中。在-20℃冰箱中儲存不宜太久。
4.1.4血液樣本建議使用PAXgene管（BD）保存。
4.1.5 RNA樣本儲存于-80℃冰箱中。
4.1.6 病理檢測樣本包好的蠟塊常溫保存；冰凍樣本在4%多聚甲醛固定24h，蔗糖梯度脫水（15%，30%），4℃保存運輸，最后OCT包埋；電鏡樣本米粒大1cm3待檢測樣本2.5%的戊二醛固定，4℃避光保存。
5 樣本運輸
5.1 干冰運輸
5.1.1飛機運輸干冰上限約為2公斤，超過(guò)2公斤原則上不能運輸?；疖?chē)運輸不受限制。
5.1.2干冰運輸應采用壁厚且質(zhì)量完好的泡沫箱，材料用編號后的凍存管存放，
用塑料袋包裝后埋入干冰中，泡沫箱應扣嚴并用封箱帶封嚴。外套紙殼箱包裝，以免碰裂。并標明輕取輕放提示，以保證安全運輸。
5.1.3干冰運輸可委托當地快遞公司，注意一定要確保48小時(shí)送達我方手中，不
能送貨上門(mén)的應提前通知我方。
5.1.4 24小時(shí)到達的，干冰數量不得低于5公斤； 48小時(shí)到達的，干冰數量不
低于8公斤。夏季可以適當再多增加部分干冰（平時(shí)的1.5倍）。超過(guò)48小時(shí)到達的，建議不要用此法運輸。
5.1.5運輸時(shí)可在干冰上再放一排液體冰袋。
5.1.6如委托快遞運輸，運輸過(guò)程中應隨時(shí)跟蹤貨物的情況，記錄貨單號，并保持與發(fā)出地和接收地的快遞公司的聯(lián)系。
5.2 冰袋（Gel Ice or Ice Pack）
5.2.1如能確保樣本在24小時(shí)內到達本公司的，以下幾種類(lèi)型樣本可使用冰袋運
輸。
5.2.2保存于RNAlater中的組織樣本。
5.2.3保存于TRIzol中的細胞樣本或經(jīng)過(guò)勻漿的組織樣本。
5.2.4用于抽提DNA的新鮮抗凝全血樣本。
6 注意事項
6.1為確保實(shí)驗的順利，我們強烈建議您在取樣時(shí)，應同時(shí)備份2~3份，如備3份，則送給我們兩份，如果備份2份，則送樣一份，您自己留一份，以防備部分樣本降解，重新取材或送樣耽誤您的時(shí)間。即使樣本全部合格，備份的樣本您還可以用來(lái)進(jìn)行其他方面的實(shí)驗（如定量驗證，蛋白方面，生化方面的實(shí)驗等）。
6.2備份又分為兩種，一種為嚴格備份，即：樣本取下后一分為二，這樣的兩份樣本基本上具備同性質(zhì)。另一種為非嚴格備份，即生物學(xué)重復的樣本，這樣的備份樣本同質(zhì)性要較前者差。
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