細胞生物學(xué)平臺

細胞分選：流式分選與磁珠分選



 

什么是細胞分選？

細胞分選（cell sorting）是根據細胞所具有的特性將某種特定的細胞亞群從混合的細胞樣品中分離出來(lái)的一種技術(shù)，是細胞學(xué)研究的重要課題。在需要對某種特定的細胞進(jìn)行功能分析時(shí)，如對細胞培養上清液通過(guò)ELISA分析檢測細胞分子、細胞共培養檢測細胞功能等研究都以獲得高純度的目的細胞為前提。
常用的細胞分選的方法有兩種：流式細胞分選和免疫磁性細胞分選。

流式細胞分選

流式細胞分選是在流式細胞術(shù)檢測細胞表型的基礎上，使用充電分選技術(shù)以實(shí)現多種特定表型細胞的分離。具有分選參數多、群體多、純度高、靈活性強等優(yōu)勢。分選后細胞可做進(jìn)一步分子生物學(xué)研究如熒光定量PCR、WB、細胞培養等。

分選型流式細胞儀一般由液流系統、光路系統、檢測分析系統和分選系統4部分組成。分選功能是通過(guò)鞘液流形成的含有細胞的帶電液滴而實(shí)現的，在流動(dòng)室的噴嘴上裝有一個(gè)高速振蕩器，該裝置充電后以每秒幾萬(wàn)次的振動(dòng)頻率使鞘液流成為上萬(wàn)個(gè)液滴，細胞在進(jìn)入液滴之前已經(jīng)被測定，如果其特性與被選定要進(jìn)行分選的細胞特性相符，則儀器會(huì )對此細胞形成液滴時(shí)給整個(gè)液柱充以指定的電荷（對標有熒光素的細胞液滴帶以負電荷；未標記熒光素的細胞液滴帶以正電荷；而不含有細胞的液滴則不被帶電荷）。這樣，當被選定的細胞形成液滴時(shí)就帶有特定的電荷，未被選定的細胞和空白液滴不被充電，即不帶電荷。當充以不同電荷的含細胞的鞘液流經(jīng)帶有正負幾千伏恒定電場(chǎng)的偏轉板時(shí)，就根據自身所帶的電荷性質(zhì)產(chǎn)生偏差而落入各自的收集管中，不帶電荷的液滴就進(jìn)入廢液槽中，從而實(shí)現細胞分選的目的。
 
操作流程
1.先制備單細胞懸液（可檢測多種樣本的單細胞懸液：外周血、骨髓、細胞穿刺液、洗脫液、實(shí)體組織、培養細胞等，如果是無(wú)菌實(shí)驗應該注意無(wú)菌操作）
2.樣本染色：調節電壓與選取目的細胞群（分選前應該做一個(gè)預實(shí)驗，優(yōu)化儀器的測定條件，建立分選門(mén)）
3.細胞分選與收集

流式細胞分選的應用

基于流式細胞術(shù)的技術(shù)基礎，根據顆粒特性實(shí)現細胞分選而廣泛應用于免疫學(xué)、細胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、藥物開(kāi)發(fā)以及環(huán)境檢測等各方面科學(xué)研究和工作中。例如：
1、用于分選外周血細胞：根據細胞的大小以及顆粒度等特征，對白細胞直接進(jìn)行分選獲取人外周血單核細胞，既避免了多次重復離心，又能分選得到純度80%-90%之間的單核細胞用于后續實(shí)驗，為深入研究單核細胞提供了良好的平臺；
2、用于分選染色體：能得到高質(zhì)量的單個(gè)染色體，且在實(shí)驗的同時(shí)純化大量染色體，為后續實(shí)驗提供了方便；此外還包括干細胞組織研究、移植和細胞治療研究以及疾病細胞的發(fā)生、發(fā)展研究等。

 

免疫磁性細胞分選

免疫磁珠細胞分選是基于細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性抗體結合的特性，在外加磁場(chǎng)中，通過(guò)抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，而無(wú)該種表面抗原的細胞由于不能與連接著(zhù)磁珠的特異性抗體結合不具磁性，從而不在磁場(chǎng)中停留達到細胞分離的目的。
磁珠細胞分選所需設備簡(jiǎn)單，對技術(shù)人員要求不高，分選所得細胞靈敏度高、純度好且細胞活性和復蘇率較好，對于下游應用影響較小，應用前景較廣。

免疫磁性分選策略

免疫磁珠細胞分選依據可以分為兩類(lèi)。一類(lèi)是根據所標記細胞的不同分為陽(yáng)性分選和陰性分選；另一類(lèi)是根據分選方法不同分為直接分選法和間接分選法。
（1）依據標記細胞的不同分類(lèi)
1、陽(yáng)性分選：將目的細胞相對應的特異性抗體與磁珠相連后加入混合細胞懸液進(jìn)行孵育。在抗原抗體發(fā)生特異性結合后，以磁分離的方式將目的細胞分離出來(lái)
2、陰性分選：從多細胞懸液中分離去除非目的細胞最后得到目的細胞。但在靶細胞的細胞數所占比例比較小時(shí)，分選過(guò)程中存在的非特異性吸附會(huì )直接導致目的細胞的損失。
3、復合分選：是聯(lián)合兩種以上的分選策略進(jìn)行分選，例如先陰性分選去除非目的細胞，再陽(yáng)性分選分離目的細胞等。此種方法主要用于細胞亞群的分選或是分離得到高純度的稀有細胞。
（2）根據不同分選方法分類(lèi)
· 直接分選法：將抗體或親和配體直接包被在磁性顆粒上，形成免疫磁性復合顆粒。將其與多細胞懸液混合孵育之后，目的細胞會(huì )特異性的結合在免疫磁珠上，在外加磁場(chǎng)的作用下，帶有磁珠的目的細胞滯留在磁場(chǎng)中，而非目的細胞則會(huì )被去除。
· 間接分選法：目的細胞首先與對應的一抗孵育，激活細胞之后清洗去除未結合的一抗，后再加入預先包被有二抗的磁性顆粒與活化后的細胞進(jìn)行孵育，一抗與二抗之間的相互作用使得磁粒結合在目的細胞上，同樣在磁場(chǎng)作用下滯留目的細胞達到分選目的。

 

細胞分選方法的選擇

對于流式細胞分選與免疫磁性細胞分選，不同的分選方式各有優(yōu)勢不能互相取代。流式分選可進(jìn)行多參數分選以及不同熒光強度的分選，但對設備要求較高，對細胞刺激較大但分選靈活可以達到多方面的分選要求；磁珠分選操作簡(jiǎn)單，分選速度快，細胞活性好，對設備和技術(shù)員的要求較低，但只能通過(guò)一種標記進(jìn)行分選。
如果磁珠分選能達到研究要求，一般首選磁珠分選，若磁珠分選達不到要求則再考慮用流式進(jìn)行分選。下表為兩種分選方法的比較：

當有以下幾種實(shí)驗要求時(shí)，細胞分選只能采用流式細胞分選而不能采用免疫磁珠細胞分選：
1、當需要非常高純度（95%-100%）的目標群體時(shí)；
2、用于分離其表面上具有低密度受體的群體；
3、根據表面受體密度濃縮表達量不同的群體；
4、基于多色染色分選細胞；
5、基于內部染色（例如DNA或胞內抗原）分選細胞。

參考文獻：

[1] 黃瑩瑩. 流式細胞分選術(shù)的應用進(jìn)展【J】.醫學(xué)部公共平臺
[2] 高敏. 基于金磁微粒的免疫磁性細胞分選方法的建立【J】.中國學(xué)位論文全文數據庫.2013

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