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實(shí)驗動(dòng)物的灌注固定方法和注意事項

關(guān)鍵詞：實(shí)驗動(dòng)物模型公司  動(dòng)物實(shí)驗外包   動(dòng)物實(shí)驗課題外包 病理染色 病理切片 動(dòng)物模型構建公司  動(dòng)物模型制作公司  第三方檢測機構 國內第三方檢測機構


灌注固定主要用于神經(jīng)系統，對神經(jīng)系統防止變性。
 
小鼠灌注

灌流固定小鼠時(shí)我一般采用輸液器的針頭 (4 號半，這樣肉眼可見(jiàn)就是肺部明顯充氣脹大變白，針頭要從心軸方向進(jìn)針，刺入心尖 3~4 毫米左右就可以了，開(kāi)始灌流后剪破右心耳，約 40 毫升生理鹽水，后再灌流約 20 毫升多聚甲醛，整個(gè)灌流固定的過(guò)程就完成了。
 
大鼠灌注

按大鼠體重，用 2% 戊巴，比妥鈉（0.25ml/100g）進(jìn)行腹腔注射麻醉，開(kāi)胸暴露心臟，向左心室內注射 1% 肝素鈉 0.2ml 后經(jīng)左心室行主動(dòng)脈插管， 血管鉗固定后剪開(kāi)右心耳，先以生理鹽水 150ml 快速沖洗血管，然后用 4% 多聚甲醛的 0.01mol/LPBS（4℃，PH7.40）250ml 灌注固定，先快后慢，共需時(shí)間為 50min，之后取材，置 4% 多聚甲醛固定液后固定，在 4℃冰箱內保存。多聚甲醛進(jìn)入大鼠體內，大鼠會(huì )出現四肢、尾的抽搐，最終 以肝臟發(fā)白、內臟鼓起即灌注好。
 
腦組織免疫組化實(shí)驗

1. 灌注固定用的針頭，一般都用注射針頭。灌注大鼠一般可用 10 到 12 號針頭，小鼠可用 6、7 號針頭，但很重要的一點(diǎn)是要把針頭的尖端磨鈍而不是用銳利的針頭。
2. 關(guān)于穿刺：灌注大鼠時(shí)要把穿刺針的尖端插入到升主動(dòng)脈內，但不宜進(jìn)入升主動(dòng)脈過(guò)長(cháng)，在動(dòng)脈內見(jiàn)到針頭或插入約 1mm 左右即可；灌注小鼠時(shí)只要把針頭插入左心室內即可，不必要插入到升主動(dòng)脈內。操作的要點(diǎn)是：第一，操作要迅速，剪開(kāi)膈肌后，迅速沿腋前線(xiàn)剪開(kāi)胸壁，并把胸前壁往上翻，暴露心臟；第二，一定要在明視野下操作，要剪開(kāi)心包壁層的前壁，暴露升主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈干的根部，確保穿剌針能進(jìn)入升主動(dòng)脈；第三，穿刺之前要用適當大小的血管鉗夾住心室以固定心臟，但不要夾得過(guò)緊，要讓心腔內留有一定的間隙，然后在心尖處輕輕旋轉針頭插入穿刺針。也可以用小剪刀在心尖處先剪開(kāi)一個(gè)小口再插入穿刺針；第四，穿刺方向要正確，從心尖部開(kāi)始，從左下方斜向右上方，若遇阻力要改變方向再試，不要用力蠻插。
3. 灌注用生理鹽水的量大鼠用 50ml 左右，小鼠用 10ml 左右，一般以從右心耳流出的液體清亮為標準；4% 多聚甲醛用量約相當于老鼠體重，如 300 克的老鼠用 300ml 左右。小鼠一般用 20-30ml。灌注速度先快后慢，可持續 1-2 個(gè)鐘頭，也可以稍快。取腦后置腦塊于 4% 多聚甲醛內 4 度后固定 4-6 個(gè)鐘頭。
 
難點(diǎn)與關(guān)鍵點(diǎn)

將灌注針插入主動(dòng)脈內是灌注固定的關(guān)鍵，也是難點(diǎn)。首先準確找到主動(dòng)脈，這是此步驟的要點(diǎn)?？捎脺厣睇}水將胸腔內的血液沖洗干凈，用眼科鑷子輕輕夾住心 外膜（夾的越少越好，以免影響取材）將心臟向左上方提起，即可看清主動(dòng)脈，又可使灌注針很容易地插入主動(dòng)脈內。插入時(shí)動(dòng)作要慢，針尖方向不要偏向右側，以 免刺入右心房，如果感到有阻力，則將針退后、調整方向重新進(jìn)針，直到進(jìn)入主動(dòng)脈，灌注針進(jìn)入主動(dòng)脈后可在心臟的上方看到其位置，灌注針進(jìn)入主動(dòng)脈的長(cháng)度最 好為 3~5 毫米，然后用絲線(xiàn)扎緊。切勿將灌注針?lè )旁谧笮氖覂?，這樣由于主動(dòng)脈瓣的關(guān)閉，灌注液很難進(jìn)入主動(dòng)脈，而是沿著(zhù)心室的切口流出，致使灌注失敗。另 外，灌注針插入成功后，一定要用剪刀剪開(kāi)右心耳而不是右心室，這是灌流液的出口。剪開(kāi)心尖的位置一定要掌握好，不能偏右使灌注針插入右心室。
 
注意事項

1. 針頭大小與動(dòng)物的種類(lèi)有關(guān)，t 同時(shí)針頭一定要磨鈍。
2. 檢查灌注泵的運作情況，一定排出管子的氣泡和空氣，防止空氣栓塞。
3. 經(jīng)腹腔暴露胸腔，先清楚升主動(dòng)脈外面的脂肪組織和心外膜組織。
4. 將針頭經(jīng)左心室插入升主動(dòng)脈（顏色變白的哦），并用鉗子固定。
5. 解開(kāi)右心耳，同時(shí)開(kāi)啟灌注泵。注意，不要隨便揭開(kāi)心臟的其他部位，否則有時(shí)候可能會(huì )灌注成功但是絕大部分會(huì )造成灌注不成功，尤其肺水腫。
6. 將 4 度的生理鹽水（最好以動(dòng)物的肝臟發(fā)白為標準，我們實(shí)驗室的大鼠約用 250ml）和多聚甲醛 (根據所取得材料而定) 依次灌入。
7. 整個(gè)過(guò)程均應將動(dòng)物放在冰上，以便于更好地保存目的蛋白和酶的活性。
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