蛋白質(zhì)純化的主要方法及注意事項
關(guān)鍵詞：分子生物學(xué) 實(shí)驗室 Western blot 蛋白質(zhì)提取 分子檢測 第三方檢測機構 第三方檢測
蛋白質(zhì)的分離純化在生物化學(xué)研究應用中使用廣泛，是一項重要的操作技術(shù)。 一個(gè)典型的真核細胞可以包含數以千計的不同蛋白質(zhì)，一些含量十分豐富，一些僅含有幾個(gè)拷貝。為了研究某一個(gè)蛋白質(zhì)，必須首先將該蛋白質(zhì)從其他蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)分子中純化出來(lái)。
一、主要方法
1. 蛋白質(zhì)的選擇吸附分離（利用顆粒不同程度的顆粒吸附力來(lái)使分離的目的達到）。
2. 按照配體特性的分離-親和層析（利用蛋白質(zhì)分子與另一種稱(chēng)為配體的分子能夠特異結合這一生物性質(zhì)）。
3. 低溫有機溶劑沉淀法，使用如甲醇，乙醇等與水可混溶的有機溶劑，降低多數蛋白質(zhì)的溶解度并且將其析出，和鹽析相比較，這種方法的分辨率更加的高，然而蛋白質(zhì)比較容易變形，需要在低溫下進(jìn)行。
4. 按照分子大小不一樣的方法，密度梯度離心（在介質(zhì)中對蛋白質(zhì)離心時(shí)，蛋白質(zhì)沉降速度取決于它的質(zhì)量和密度，質(zhì)量和密度越大，那么沉降越快；凝膠過(guò)濾（一種柱層析）；超過(guò)濾（利用蛋白質(zhì)分子不能從半透膜通過(guò)的性質(zhì)）。
5. 按照溶解度差異分離，等電點(diǎn)沉淀法鹽溶與鹽析（使用一定濃度鹽溶液來(lái)使蛋白質(zhì)的溶解度增大或減?。?；（因為在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)分子的凈電荷為 0，使分子間靜電斥力減少了，所以，聚集沉淀比較容易，這時(shí)具有最小的溶解度）。
6. 按照電荷不同的分離方法。主要分為離子交換層析和電泳分離。
二、操作步驟：
1. 所有在純化系統里使用的溶液當日都需要經(jīng)過(guò) 0.22μm 的濾膜抽濾、脫氣處理；保存 4℃ 冰箱里的緩沖液若要在室溫使用需恢復至室溫后抽濾脫氣；
2. 樣品上柱純化前，需先濾膜過(guò)濾，少量樣品可用離心（13000rpm，10min）；
3. 依次用水、緩沖液洗泵；設置流速和柱前警報壓（壓力值參閱層析柱及填料說(shuō)明書(shū)，取較小的一個(gè)最大耐受壓力）。防止柱中進(jìn)入氣泡，影響分離效果；
4. 當柱子限壓在 0.3MPa，或者在限壓狀態(tài)下流速很低時(shí)，pH valve 中的 Restirtor 可以切換成 Off line，即顯示 By-pass 狀態(tài)；
5. 當需要通過(guò)儀器上樣環(huán)上樣時(shí)，將 W1 閥口處換成帶透明短軟管的閥門(mén)，從此處閥門(mén)位通過(guò)注射器倒吸樣品上樣；
6. 進(jìn)樣閥「Inject」為上樣狀態(tài)。上樣結束可將進(jìn)樣閥切換回「Load」狀態(tài)。并用純水認真清洗上樣環(huán)至少 3 次；將 W1 閥口處換回原來(lái)接頭閥門(mén)。
7. 純化結束后，用純水清洗泵和平衡柱子；再用 20% 的乙醇清洗泵以及系統。長(cháng)期不用，層析柱應保存在 20% 的乙醇中，泵放置在 20% 乙醇中；
8. 實(shí)驗結束后及時(shí)傾倒廢液瓶里的廢液；
三、注意事項
1. 為了避免蛋白質(zhì)變性，不要對樣品劇烈攪動(dòng)和反復凍融。
2. 緩沖溶液成分盡量模擬細胞內環(huán)。。
3. 為了避免蛋白質(zhì)的氧化，將 0.1～1 mmol/LDTT（二硫蘇糖醇）(或 β-巰基乙醇）加入到緩沖溶液中。
4. 為了避免重金屬對目標蛋白的破壞，將 1～10 mmol/LEDTA 金屬螯合劑加入。
5. 為了避免微生物生長(cháng)，使用滅菌溶液。在純化任何一種蛋白質(zhì)的時(shí)候，均必須時(shí)刻對它的穩定性注意維護，使它的活性得到保護，需要牢記如下一些通用的注意事項。
6. 盡可能置于冰上或者在冷庫內進(jìn)行操作。
7. 蛋白濃度不要太稀。
8. 除非是進(jìn)行聚焦層。否則 pH 需要合適，防止所使用的緩沖溶液 pH 與 pI 相同，使蛋白質(zhì)的沉淀得以避免。
9. 使用蛋白酶抑制劑，避免蛋白酶對目標蛋白的降解；在純化細胞中的蛋白質(zhì)時(shí)，將 DNA 酶加入來(lái)使得 DNA 降解，避免 DNA 對蛋白的污染。
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