細胞生物學(xué)平臺

細胞三維（3D）培養

細胞在平面上生長(cháng)是人為的和不自然的，因為這與細胞能夠以最佳狀態(tài)進(jìn)行旺盛生長(cháng)的體內環(huán)境并不相同。因此，傳統的2D單層細胞培養物很難恰當地反映出細胞的體內生長(cháng)環(huán)境，進(jìn)而可能造成細胞結構和組織功能的缺失。

三維（3D）細胞培養技術(shù)能夠更好地模擬生物體內細胞存活的自然環(huán)境，其自然條件可保持細胞間相互作用和更逼真的生化和生理反應。在3D環(huán)境中，細胞對內源性和外源性刺激（如溫度、pH、營(yíng)養吸收、轉運和分化等方面的改變）應答更接近于它們在體內的反應。再生醫學(xué)的力量為理解發(fā)育、老化和組織年輕化等許多有趣的細胞進(jìn)程提供了方法，了解生物學(xué)中這些有趣過(guò)程的唯一方法就是研究與生物體非常相似的模型系統，這使得3D細胞培養成為必不可少的研究工具。

3D細胞培養技術(shù)很多，但總結起來(lái)可以分為3類(lèi)：

~3D水凝膠~
1.基本原理：
水凝膠是水膨脹性的高分子網(wǎng)絡(luò )，被設計用來(lái)模擬復雜的細胞外微環(huán)境。水凝膠由水、ECM蛋白和生長(cháng)因子組成。用于三維細胞培養的第一代水凝膠是從小鼠肉瘤細胞基底膜提取的ECM聚合物，新一代的合成、混合或基于多肽的材料則可以制備滿(mǎn)足特定需求的培養環(huán)境，為每個(gè)細胞和應用需求提供最合適的選擇

2.技術(shù)舉例：
2.1 天然水凝膠
ECM凝膠：從小鼠肉瘤細胞基底膜提取的天然ECM，可以提供非常豐富的營(yíng)養，與細胞的發(fā)育具有高度兼容性。ECM的主要組分是層粘連蛋白、IV型膠原、蛋白多糖硫酸乙酰肝素和巢蛋白。這種水凝膠聚合物可通過(guò)20-40°C熱激活，凝膠化過(guò)程也是可逆的(蛋白質(zhì)濃度:8–12mg/ml)。

MaxGel™ 胞外基質(zhì)：MaxGel人細胞外基質(zhì)源于體外培養的細胞基底膜，含有可預測的低水平內源生長(cháng)因子，更適合需要更明確和特征再造BME的應用，最終可降低實(shí)驗的可變性。MaxGel人細胞外基質(zhì)（ECM）含有多種細胞外基質(zhì)成分，包括膠原蛋白、層粘蛋白、纖連蛋白、腱生蛋白、彈性蛋白以及大量的蛋白聚糖及粘多糖等。用于細胞培養的ECM可以高效地重現上皮細胞與間質(zhì)在皮膚發(fā)育及器官型細胞培養過(guò)程中的協(xié)同作用。MaxGel™可以促進(jìn)細胞生長(cháng)和遷移，已被證實(shí)可以促進(jìn)多種類(lèi)型細胞的增殖，包括神經(jīng)干細胞、神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞。

Cultrex® 3-D培養工具： 3-D Culture MatrixTM RGF BME低生長(cháng)因子基底膜抽提物，經(jīng)過(guò)效果驗證，專(zhuān)為滿(mǎn)足三維培養研究的需求而研制。為了提供最標準化的3D培養基底膜抽提物產(chǎn)品，采用一套特殊工藝來(lái)降低生長(cháng)因子以更好的保證批間一致性，并將基質(zhì)的標準濃度控制在15 mg/ml左右，隨后在三維培養條件下對本品的效能進(jìn)行評估驗證。

在3-D Culture Matrix™ RGF BME中培養16天后，對MCF-10A細胞進(jìn)行染色：A）細胞染色試劑盒（結構）；B）SYBR®Green（細胞核）；C）MitoShift™（線(xiàn)粒體膜電位）； 3-D Culture Matrix™ RGF BME中培養12天后，對PC-3細胞進(jìn)行染色：D）Calcein AM（細胞活力）；E）CPA染料1（細胞核）；F）Depsipher™（線(xiàn)粒體膜電位）

天然水凝膠技術(shù)優(yōu)勢：
-建立已久，支持文獻和應用較多
-提供天然生物配體
-通常含有生長(cháng)因子和細胞因子

2.2 合成水凝膠
HyStem™細胞培養支架— 首款定制合成的ECM
HyStem產(chǎn)品是首個(gè)可定制的合成ECM，與體內條件非常相近。使用HyStem 平臺，研究人員可控制生長(cháng)因子、黏附因子和ECM 蛋白的摻入、水凝膠硬度及細胞囊化等。由于HyStem 是一種合成的基質(zhì)，而不是生物提取物，所以研究人員能夠密切控制細胞環(huán)境的組成。HyStem 的成分包括化學(xué)合成的HyStem（巰基化透明質(zhì)酸）、Extralink™（硫醇反應性交聯(lián)劑）、脫氣的水和生物純化的Gelin-S™（變性膠干細胞的天然環(huán)境富含透明質(zhì)酸，因此，HyStem 試劑盒是培養干細胞的最佳選擇。HyStem 水凝膠支架精密模仿了天然的細胞外基質(zhì)環(huán)境，含有豐富的透明質(zhì)酸和膠原纖維，同時(shí)具有定制靈活性，能加入適當的生長(cháng)因子、附著(zhù)因子和蛋白。

Hystem可模擬天然的ECM結構

HydroMatrix™多肽水凝膠
HydroMatrix™水凝膠是一種合成多肽納米纖維支架，通過(guò)高度交聯(lián)的多肽水性凝膠中的天然三維結構來(lái)實(shí)現對合成基質(zhì)的精確控制。HydroMatrix支架可以在溫度或離子強度變化刺激下從液態(tài)前體自組裝為高度交聯(lián)的三維多肽水性凝膠。通過(guò)調整HydroMatrix溶液的濃度，研究人員可以控制3-D結構的柔韌性，并對結構進(jìn)行剪裁以滿(mǎn)足個(gè)人需求。HydroMatrix™可以促進(jìn)細胞生長(cháng)和遷移，已被證實(shí)可以促進(jìn)多種類(lèi)型細胞的增殖，包括神經(jīng)干細胞、神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞。

HydroMatrix多肽水凝膠可支持極佳的細胞生長(cháng)環(huán)境。大鼠神經(jīng)干細胞(NSCs)在3種平面上進(jìn)行培養：NSCs在組織培養塑料平面生長(cháng)很差(A)，在多聚賴(lài)氨酸/層粘蛋白處理的平面上長(cháng)勢稍好(B)，但在0.5% (w/v)的HydroMatrix多肽水凝膠上表現出極佳的生長(cháng)狀態(tài)(C)

合成水凝膠技術(shù)優(yōu)勢:
-明確無(wú)動(dòng)物源成分和病原物
-無(wú)生長(cháng)因子，無(wú)批間差異
-可通過(guò)額外添加特異的生物相關(guān)氨基酸序列實(shí)現進(jìn)一步功能化

~細胞聚集~
1.基本原理：
基于細胞聚集的方法不需要額外添加細胞外基質(zhì)蛋白，細胞會(huì )產(chǎn)生內源的細胞外基質(zhì)蛋白并不斷聚集形成較大的聚集體。由此形成的球體大小和組分取決于起始細胞數量、孵育時(shí)間和細胞增殖率等因素。

2.技術(shù)舉例：
2.1懸滴培養板
Perfecta3D®懸滴培養平板的孔板經(jīng)過(guò)特殊設計，當在小孔上方加入一滴細胞懸液時(shí)，孔板的幾何構造就會(huì )引導細胞和培養基通過(guò)一個(gè)小洞，進(jìn)而形成一個(gè)穩定的懸滴。滴入口位于每個(gè)培養孔的上方，可用來(lái)更換培養基，添加外源胞外基質(zhì)、生長(cháng)因子、小分子，也可用來(lái)加入細胞形成混合培養物。Perfecta3D®懸滴培養板每孔形成一個(gè)球體，且可控制球體大小以確保數據的穩定性。 96孔和384孔懸滴培養板與自動(dòng)化液體處理設備、微孔板讀數儀等兼容。

懸滴培養板技術(shù)優(yōu)勢：
-球體大小和數量可控制，孔間數據可重復
-可使用液體處理系統實(shí)現自動(dòng)化
-使用較大球體可模擬缺氧狀態(tài)
-提供細胞混合的靈活性，種植前或球體形成后即可

2.2低粘附平面
Corning極低吸附平面是一種共價(jià)偶聯(lián)了水凝膠的親水不帶電平面，以盡可能的降低細胞貼附、蛋白吸收和酶活性，維持細胞以懸浮不貼壁的狀態(tài)生長(cháng)。

低粘附培養平面技術(shù)優(yōu)勢：
-可形成較大的球形體
-U型或V型底的96/384孔平板每孔可產(chǎn)生單個(gè)球體

2.3 3D Petri Dish
MicroTissues 3D 培養皿是不基于支架的天然3D 細胞培養環(huán)境，可最大限度模擬細胞間的相互作用和信號交流。該產(chǎn)品線(xiàn)包括多種規格的微組織培養系統，適配標準的12孔和24孔培養板，可應用于形成球狀體、乳腺癌細胞球、膠質(zhì)瘤細胞球、肝細胞球、軟骨細胞球、骨細胞球、神經(jīng)細胞球、心肌細胞球，以及細胞聚集體和擬胚體等多種細胞培養模式。

3D 培養皿制備流程圖

3D 培養皿技術(shù)優(yōu)勢：
-單次移液操作即可獲得上百個(gè)相同大小的球體
-可從單細胞克隆形成球體
-可在同一平面對一組球體進(jìn)行成像
-可形成復雜形態(tài)的微組織

~培養支架~
1.基本原理：
支架可提供一種物理支撐，細胞可以進(jìn)入支架生長(cháng)和行使功能?？紫斗植?、暴露平面區域和孔隙度具有關(guān)鍵作用，其數量和分布會(huì )影響細胞滲透入支架的效率，而依據不同的制作工藝，支架具有不同的結構、隨機或定制的孔隙分布。

支架可以通過(guò)包被或功能化以產(chǎn)生不同的特性和影響細胞的生長(cháng)和行為，且有些“支架”技術(shù)還和“水凝膠”技術(shù)有著(zhù)密切的關(guān)系。

2.技術(shù)舉例：
支架的種類(lèi)很多，基本可以分為：1. 天然支架如膠原、明膠、纖維蛋白、幾丁聚糖、粘多糖、瓊脂糖和海藻酸等，天然支架具有生物兼容性，但穩定性較差；2. 合成支架如聚苯乙烯、聚己內酯、聚氨酯等，合成材料具有一致性、穩定性，但惰性、堅硬，生物兼容性較差

培養支架技術(shù)優(yōu)勢：

-可實(shí)現器官型共培養-模擬分層的組織結構
-與現有的塑料制品格式和下游分析方法兼容
-結構一致具有可重復性，兼容高通量

小結：不同3D細胞培養技術(shù)都各有優(yōu)勢和不足，因此在選擇合適的3D細胞培養系統時(shí)需要考慮多方面因素，比如要解決的問(wèn)題或研究目的、實(shí)驗模型、細胞類(lèi)型、技術(shù)可實(shí)現性、下游分析方法和樣品數量等。
 
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