細胞生物學(xué)平臺

siRNA實(shí)驗原理以及常見(jiàn)問(wèn)題

siRNA 敲低技術(shù)在很多實(shí)驗中用來(lái)評估細胞內蛋白質(zhì)的功能。這項技術(shù)常被用于研究從細胞中去除相應蛋白質(zhì)之后所產(chǎn)生的變化：

 例如敲低之后是否影響細胞活性？是否為致死敲除？

是否會(huì )影響其它蛋白質(zhì)（尤其是信號轉導通路中的蛋白質(zhì)）的表達水平？

是否影響其它蛋白質(zhì)在細胞中的位置？以及對細胞表型、形態(tài)和功能產(chǎn)生哪些影響？

什么是siRNA ？

小干擾 RNA (siRNA) 是由 20-25 個(gè)核苷酸組成的雙鏈 RNA 分子，在細胞中具有多種功能。在 RNA 干擾 (RNAi) 通路中，siRNA 通過(guò)與互補 mRNA 分子雜交干擾基因表達。這種干擾會(huì )觸發(fā) mRNA 降解，進(jìn)而抑制特定基因的基因表達。

siRNA 于 1999 年由 David Baulcomb 實(shí)驗室首次發(fā)現。2001 年，Thomas Tuschl 提出合成 siRNA 會(huì )在哺乳動(dòng)物細胞中誘導 RNA 干擾 (RNAi)。如今，專(zhuān)門(mén)設計用于與 RNA 靶序列雜交并使其降解的“合成”siRNA 寡核苷酸已被廣泛用于誘導細胞 RNAi。靶 mRNA 的降解能夠有效“敲除”相應蛋白質(zhì)的表達。然后可研究分析靶蛋白濃度降低造成的影響。

siRNA 的作用原理

 利用短寡核苷酸 siRNA 或能夠轉錄 siRNA 的 DNA 質(zhì)粒將雙鏈 RNA (dsRNA) 引入細胞。細胞中的 Dicer 蛋白將 dsRNA 消化為 21 bp 的 dsRNA (siRNA)。 siRNA 被整合到 RNA 誘導沉默復合體 (RISC) 中。在 RISC 復合體中，dsRNA 發(fā)生鏈分離。其反義鏈與細胞中的互補/靶 mRNA 雜交。活化 RISC 中的核酸酶降解靶 mRNA。斷裂的 mRNA 無(wú)法翻譯成蛋白質(zhì)。也就是說(shuō)蛋白質(zhì)無(wú)法表達，從而成功“敲除”蛋白質(zhì)。

敲低效果驗證方法：

RT-PCR

檢測mRNA，是否仍存在靶 mRNA？或是否敲低成功？

這種方法非常靈敏，但無(wú)法準確預測蛋白質(zhì)水平。

蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗

使用抗體來(lái)檢測樣品中的靶蛋白表達以及多種相關(guān)蛋白質(zhì)表達，從而觀(guān)察靶蛋白敲除對其它蛋白質(zhì)的影響。

免疫細胞化學(xué)法

可檢測是否存在敲低蛋白。

其優(yōu)勢在于利用雙重染色法，可同時(shí)檢查敲除對其它蛋白質(zhì)表達的影響以及其它蛋白質(zhì)在細胞中的位置。